Этапы пцр диагностики. Принципы пцр-диагностики. Нужна помощь по изучению какой-либы темы

Генетика бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

Выделенную ДНК из исследуемого образца,

Буферный раствор,

Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus ).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

Денатурация (температура 94 о С) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60 о С) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

Элонгация (температура обычно 72 о С) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

Динамика ПЦР

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2 n , где m – исходное количество искомой ДНК в пробе, n – число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2. Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

Рисунок 3. Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. (а) – наибольшая концентрация (б) – промежуточная концентрация (в) – наименьшая концентрация

Рисунок 4. Агарозный электрофорез продуктов ПЦР. К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК). 1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные). K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК). Во многих случаях помимо целевого продукта видны более легкие неспецифические продукты реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы детекции при использовании ПЦР в реальном времени. (а) – интеркалирующий краситель – флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК (б) – зонд Taqman – флуоресценция возникает при расщеплении зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной активностью за счет разделения флуорофора и гасителя. (в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценция возникает при гибридизации зонда с целевым фрагментом за счет пространственного отдаления флуорофора и гасителя (г) – зонды LightCycler - флуоресценция акцептора возникает при гибридизации зондов (содержащих акцептор и донор) с целевым фрагментом за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии. В настоящий момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики .

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа.

Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

Помимо ДНК такую же структуру имеет РНК – рибонуклеиновая кислота, отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил. РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку. Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент -«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» - последовательности из 5-15 нуклеотидов. Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии , микоплазмы , вирусов) экспериментально.

Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

Этапы проведения ПЦР исследования

Забор биологического материала для исследования

В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I

«Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии , «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

Этап идентификации размноженного генетического материала

На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного.
Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.

ПЦР в диагностике инфекций
Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.
Основные области применения ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
2. контроль эффективности проведенной терапии
3. уточнение вида возбудителя

Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
2. герпетиформные вирусы
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. ее существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты способны выдерживать множество циклов реакции, что позволяет автоматизировать проведение ПЦР. Одна из наиболее часто использовавшихся термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -ДНК-полимеразой.

Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Реакция проводится в программируемом термостате (амплификаторе) - приборе, который может проводить достаточно быстро

охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации (рис. 6.1 и 6.2). На рис. 6.1 представлена динамика изменения температуры в пробирке при проведении цикла ПЦР.

Рис. 6.1. График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции

Денатурация ДНК-матрицы проводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Рис. 6.2. Схема первого цикла полимеразной цепной реакции

Стадия отжига праймеров. При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии - 5-60 с.

Во время следующей стадии - элонгации - происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод биохимической технологии в молекулярной биологии, проводящийся с целью увеличения одной или нескольких копий фрагментов ДНК на несколько степеней, что позволяет создать от нескольких тысяч до миллионов копий определенной последовательности ДНК.

Разработанный в 1983 году Кэри Муллисом, метод ПЦР в настоящее время является распространенным и зачастую незаменимым методом, использующимся в медицинских и биологических исследовательских лабораториях для множества различных приложений. Они включают клонирование ДНК для секвенирования, филогению на основе ДНК, или функциональный анализ генов; диагностику наследственных заболеваний; выявление генетических отпечатков пальцев (используется в отраслях судебной медицины и в проведении теста на отцовство), а также выявление и диагностику инфекционных заболеваний. В 1993 году, Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии вместе с Майклом Смитом по их работе над ПЦР .

Метод основан на термоциклировании, состоящем из повторяющихся циклов нагрева и охлаждения реакции для денатурации и репликации ДНК ферментами. Праймеры, (короткие фрагменты ДНК), содержащие последовательности, комплементарные с целевым участком наряду с ДНК-полимеразой (на основе чего метод получил название), являются ключевыми компонентами для запуска избирательной и повторной амплификации. В процессе ПЦР, сама синтезированная ДНК используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой ДНК-матрица амплифицируется в геометрической прогрессии. ПЦР может значительно модифицироваться для выполнения широкого спектра генетических манипуляций.

Почти все ПЦР-приложения используют термостабильную ДНК-полимеразу, такую как Taq-полимераза, фермент , первоначально выделенный из бактерии Thermus aquaticus . Эта ДНК-полимераза ферментативно собирает новую цепь ДНК из блоков, составляющих ДНК - нуклеотидов, используя одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и олигонуклеотиды ДНК (также называемые праймерами ДНК), которые необходимы для инициации синтеза ДНК. Подавляющее большинство методов ПЦР применяют термоциклирование, т. е. попеременное нагревание и охлаждение образца ПЦР по определенному ряду температурных этапов. Эти этапы термоциклирования необходимы сначала для физического разделения двух цепей двойной спирали ДНК при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией ДНК. При более низкой температуре, каждая цепь будет использоваться в качестве матрицы в синтезе ДНК ДНК-полимеразой для того, чтобы избирательно амплифицировать целевой участок ДНК. Избирательность результатов ПЦР с использованием праймеров, которые являются комплементарными с участком ДНК - мишенью для амплификации при определенных условиях термоциклирования.

Принципы ПЦР диагностики

ПЦР используется для амплификации определенного участка цепи ДНК (ДНК-мишень). Большинство методов ПЦР обычно амлифицируют фрагменты ДНК до ~ 10000 пар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют увеличивать фрагменты до 40 кб в размере. Реакция производит ограниченное количество конечного амплифицированного продукта, который регулируется имеющимися реактивами в реакции и обратной связью-ингибированием продуктов реакции.

Основной набор ПЦР требует нескольких компонентов и реактивов. Они включают:

• ДНК-матрицу , содержащую целевой участок ДНК, который требуется амплифицировать.
• Два праймера, комплементарные 3"-концам каждой из смысловой и антисмысловой цепей ДНК-мишени.
• Taq-полимераза или иная ДНК-полимераза, действующая при оптимальной температуре около 70 ° C.
• Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ; трифосфатные группы, содержащие нуклеотиды), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК.
• Буферный раствор , обеспечивающий подходящие химические условия для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы.
• Двухвалентные катионы, ионы магния или марганца; обычно используется Mg2 +, но также может использоваться и Mn2 + для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК, так как более высокие концентрации Mn2 + увеличивают частоту ошибок в процессе синтеза ДНК.
• Одновалентные катионы ионов калия.

ПЦР обычно проводится в реакционном объеме 10-200 мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0.2-0.5 мл) в термоциклере-амплификаторе. Амплификатор нагревает и охлаждает реакционные пробирки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции. Многие современные амплификаторы используют эффект Пельтье, который позволяет нагревать и охлаждать блок с ПЦР-пробирками просто путем изменения направления электрического тока. Тонкостенные реакционные пробирки способствуют благоприятной теплопроводности для обеспечения быстрого теплового равновесия. Старые амплификаторы, у которых отсутствует нагреваемая крышка, требуют слоя масла на поверхности реакционной смеси или шарика воска в пробирке.

Порядок процедуры

Как правило, ПЦР состоит из серий 20-40 повторяющихся изменений температуры, называемых циклами, причем каждый цикл обычно состоит 2-3 дискретных температурных этапов, обычно трех. Циклирование зачастую начинается и завершается одним температурным этапом (так называемым ожиданием ) при высокой температуре (> 90 ° C) для окончательного расширения продукта или краткого хранения. Использующиеся температуры и длительность времени их применения в каждом цикле зависит от множества параметров. Они включают в себя фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и дНТФ в реакции, и температуру плавления (Tm) праймеров.

• Этап инициализации: Этот этап состоит из нагрева реакции до температуры 94-96 ° C (или 98 ° C, если используются высоко термостабильные полимеразы), который проводится на 1-9 минут. Этап требуется только для ДНК-полимераз, которым необходима активация теплом, так называемым горячим стартом ПЦР.
• Этап денатурации: Является первым регулярным событием термоциклирования и состоит из нагревания реакции до 94-98°C в течение 20-30 секунд. Это вызывает расщепление ДНК-матрицы с разрушением водородных связей между комплементарными основаниями и образованием одноцепочечных молекул ДНК.
• Этап отжига: Температура реакции снижается до 50-65°С в течение 20-40 секунд, что позволяет праймерам связаться с одноцепочечной матрицей ДНК. Обычно температура отжига составляет около 3-5 градусов по Цельсию ниже Tm используемых праймеров. Стабильные водородные связи ДНК-ДНК формируются только, когда последовательность праймера точнее соответствует матрице последовательности. Полимераза связывается с гибридом «праймер-матрица» и начинает синтез ДНК.
• Этап расширения / элонгации: Температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; Taq-полимераза имеет свою оптимальную температуру активности при 75-80°C; обычно используется температура 72°C для этого фермента. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, добавляя дНТФ, которые являются комплементарными матрице в направлении 5 "к 3", связывая 5"-фосфатную группу дНТФ с 3"-гидроксильной группой в конце образующейся (расширяющейся) ДНК. Время расширения зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и длины фрагмента ДНК, который необходимо амплифицировать. Как правило, при своей оптимальной температуре, ДНК-полимераза полимеризует тысячу оснований в минуту. При оптимальных условиях, т.е. при отсутствии ограничений вследствие ограничивающих субстратов или реактивов, на каждом этапе расширения, количество ДНК-мишени удваивается, что приводит к экспоненциальной (в геометрической прогрессии) амплификации фрагмента ДНК.
• Финальное удлинение: Это единственный этап, выполняющийся иногда при температуре 70-74°С в течение 5-15 минут после последнего цикла ПЦР для того, чтобы убедиться, что любые оставшиеся одноцепочечные ДНК удлинились полностью.
• Финальное ожидание: Этот этап при температуре 4-15 ° C в течение неопределенного времени может быть использован для кратковременного сохранения реакции. Чтобы проверить, синтезировала ли ПЦР ожидаемый фрагмент ДНК (также иногда называют «амплимер» или «ампликон»), применяется электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер ПЦР-продуктов определяется путем сравнения с лестницей ДНК (маркером молекулярного веса), которая содержит фрагменты ДНК известного размера, выполняется на геле наряду с ПЦР-продуктами.

Стадии полимеразной цепной реакции

Процесс ПЦР можно разделить на три этапа:

1. Экспоненциальная амплификация : В течение каждого цикла, количество продукта удваивается (при условии 100% эффективности реакции). Реакция очень чувствительна: необходимо присутствие только незначительного количества ДНК.
2. Стадия выравнивания : реакция замедляется, так как ДНК-полимераза теряет активность и потребление реактивов, таких как дНТФ и праймеры, заставляет их стать ограничивающими.
3. Плато : Продукт больше не накапливается из-за истощения реактивов и ферментов.

Оптимизация ПЦР

На практике, ПЦР может пройти не успешно по различным причинам, в частности из-за ее чувствительности к загрязнению, что вызывает амплификацию побочных продуктов ДНК. В связи с этим, был разработан ряд методик и процедур для оптимизации условий ПЦР. Загрязнением посторонней ДНК занимаются лабораторные протоколы и процедуры, которые очищают предварительно ПЦР-смеси от потенциальных ДНК-загрязнителей. Это обычно включает пространственное разделение ПЦР-комплектов от областей для анализа или очистки продуктов ПЦР, использование одноразовой пластиковой посуды и тщательную очистку рабочей поверхности между этапами проведения реакции. Методы конструирования праймеров играют важную роль в улучшении выделения продуктов ПЦР и в избегании образования побочных продуктов, а также использование альтернативных компонентов буфера или полимеразных ферментов может помочь в амплификации длинных или иначе проблемных участков ДНК. Добавление реактивов, таких как формамид, в буферные системы может увеличить специфичность и выделение ПЦР. Симуляция на компьютере теоретических результатов ПЦР (электронная ПЦР) может быть выполнена для оказания помощи в конструировании праймеров.

Применение ПЦР

Селективное выделение ДНК

ПЦР позволяет выделять фрагменты ДНК из геномной ДНК с помощью селективной амплификации конкретного участка ДНК. Это применение ПЦР дополняет многие методы, такие как создание зондов гибридизации для методов «саузерн» или «норзерн-блоттинга» и клонирования ДНК, которые требуют больших количеств ДНК, представляющих собой специфический участок ДНК. ПЦР снабжает эти методы высоким содержанием чистой ДНК, что позволяет выполнить анализ образцов ДНК, даже с небольшим количеством исходного материала.

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК с целью определения неизвестных ПЦР-амплифицированных последовательностей, в которой один из апмлификационных праймеров может быть использован в секвенировании по Сэнгеру, выделении последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду или генетический материал другого организма. Можно быстро провести скрининг колоний бактерий (кишечной палочки) посредством ПЦР для коррекции конструкции векторной ДНК. ПЦР также можно применять для генетической дактилоскопии; методика, используемая в судебной медицине для идентификации личности или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных ПЦР - методов.

Некоторые методы ПЦР «отпечатков пальцев» имеют высокую дискриминационную силу и могут использоваться для определения генетических связей между людьми, такими как родитель -ребенок или между братьями и сестрами, и используются в выявлении отцовства. Эта методика также может применяться для определения эволюционных взаимоотношений между организмами.

Амплификация и количественная оценка ДНК

Так как ПЦР увеличивает число копий участков ДНК, которые являются мишенями, ПЦР может применяться для анализа очень малых количеств образца. Зачастую это имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы, когда доступны только следовые количества ДНК в качестве доказательств. ПЦР также может применяться при анализе древних ДНК, которым десятки тысяч лет. Эти ПЦР-методы были успешно использованы на животных, таких как сорокатысячелетний мамонт, а также на ДНК человека, в приложениях, начиная от анализа египетских мумий до идентификации русского царя.

Количественные методы ПЦР позволяют оценить количество заданной последовательности, присутствующей в образце - метод часто применяется для количественного определения уровня экспрессии гена. ПЦР в реальном времени является признанным инструментом для количественного анализа ДНК, который измеряет накопление ДНК продукта после каждого цикла ПЦР-амплификации.

ПЦР в диагностике заболеваний

ПЦР позволяет провести раннюю диагностику злокачественных заболеваний, таких как лейкемия и лимфома, которая в настоящее время является высоко развитой в исследованиях рака и уже используется в плановом порядке. ПЦР может проводиться непосредственно на геномных образцах ДНК для выявления транслокационно-специфичных злокачественных клеток с чувствительностью, которая, по крайней мере, в 10 000 раз выше, чем у других методов.

ПЦР позволяет также выявлять некультивируемые или медленно растущие микроорганизмы, таких как микобактерии, анаэробные бактерии, и вирусы из культуры ткани и моделей животных. Основанием для ПЦР диагностических приложений в области микробиологии является выявление инфекционных агентов и дифференцировка непатогенных штаммов от патогенных в силу специфических генов.

Вирусная ДНК может также выявляться с помощью ПЦР. Праймеры должны быть специфичными к целевым последовательностям ДНК вируса, и ПЦР может применяться для диагностических анализов ДНК или секвенирования генома вируса. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить вирусы вскоре после инфицирования и даже до начала заболевания. Такое раннее выявление вируса может дать врачам значительные возможности в лечении. Количество вируса («вирусная нагрузка») у пациента также может быть определено количественными методом анализа ДНК на основе ПЦР.

Вариации основных методов полимеразной цепной реакции

• Аллель-специфичная ПЦР : метод диагностики или клонирования, основанный на однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) (отличиях одного основания в ДНК). Требует предварительных знаний о последовательности ДНК, включая различия между аллелями, и использует праймеры, чьи 3"-концы охватывают SNP. ПЦР-амплификация в жестких условиях гораздо менее эффективна в присутствии несоответствия между матрицей и праймером, поэтому успешная амплификация с SNP-специфическим праймером сигнализирует о наличии специфических SNP в последовательности.
• ПЦР-сборка или сборка циклирования полимеразы (СЦП): искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем проведения ПЦР на резерве длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются между направлениями смысловой и антисмысловой цепей, и перекрывающиеся сегменты определяют порядок ПЦР-фрагментов, тем самым селективно вырабатывая окончательный длинный продукт ДНК.
• Асимметричная ПЦР : преимущественно амплифицирует одну цепь ДНК в матрице двухцепочечной ДНК. Используется в секвенировании и гибридизационного зондирования, где требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймеров для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной (в арифметической прогрессии) амплификации в конце реакции после использования ограничивающего праймера, требуются дополнительные циклы ПЦР. Последняя модификация этого процесса, известная как «LATE-PCR» (линейность после экспоненциальной фазы - ПЦР) использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (Tm), чем избыток праймера для поддержания эффективности реакции, так как концентрация ограничивающего праймера снижается в середине реакции.
• Dial-out ПЦР : высоко параллельный метод с целью получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Комплексный резерв молекул ДНК модифицируется уникальными фланговыми метками до массивного параллельного секвенирования. Tag-направленные праймеры затем обеспечивают получение молекул с заданной последовательностью с помощью ПЦР.
• Геликаза-зависимая амплификация: аналогична традиционной ПЦР, но требует постоянную температуру, чем циклирование через циклы денатурации и отжига / расширения. Геликаза ДНК, фермент, который раскручивает ДНК, используется вместо тепловой денатурации.
• Горячий старт ПЦР : методика, которая снижает неспецифическую амплификацию во время начальной настройки этапов ПЦР. Может выполняться вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры денатурации (например, 95 ° C) перед добавлением полимеразы. Были разработаны системы специализированных ферментов, которые ингибируют активность полимеразы при комнатной температуре, либо путем связывания антител, либо в присутствии ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируются только после высокотемпературной стадии активации. «Горячий старт/холодный финиш» ПЦР достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые являются неактивными при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре элонгации.
• ПЦР, специфичная к межмикросателлитным последовательностям (ISSR): ПЦР-метод ДНК-дактилоскопии, который увеличивает число копий участков между простыми повторяющимися последовательностями для получения уникального отпечатка из амплифицированной длины фрагмента.
• Инвертированная ПЦР широко используется для определения участков последовательности вокруг геномных вставок. Она включает ряд расщеплений ДНК и самостоятельного лигирования, в результате чего образуются известные последовательности на любом конце неизвестной последовательности.
• ПЦР, опосредованная лигированием: Использует небольшие линкеры ДНК, соединенные с интересующей ДНК и несколькими праймерами, связанные с линкерами ДНК; используется для секвенирования ДНК, метода прогулки по геному, и футпринтинга ДНК.
• Метилирование-специфическая ПЦР (MSP): разработана Стивеном Бэйлином и Джимом Германом в Школе Медицины Джона Хопкинса, используется для обнаружения метилирования островков CpG в геномной ДНК. ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия, который преобразует неметилированные основания цитозина в урацил, распознающийся ПЦР-праймерами как тимин. Затем проводятся две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием наборов идентичных праймеров, за исключением в любом островке CpG в пределах последовательности праймеров. В этих точках, один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для увеличения числа копий метилированной ДНК, и один набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может выполняться с целью получения количественной, нежели качественной информации о метилировании.
• Минипраймер - ПЦР: используются термостабильные полимеразы (S-Tbr), которые могут расширять от коротких праймеров («smalligos»), с числом от 9 или 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет ПЦР нацеливаться на регионы, связанные с меньшими праймерами, и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген рРНК 16S (или эукариотическая 18S).
• Амплификация зонда, зависящего от мультиплексного лигирования (MLPA ): позволяет амплифицировать множество мишеней только с одной парой праймеров, таким образом, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР.
• Мультиплексная ПЦР состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР с целью получения ампликонов разных размеров, которые специфичны к различным последовательностям ДНК. По ориентации на несколько генов одновременно, возможно получить дополнительную информацию при проведении одного теста, что в противном случае потребовало бы больше в несколько раз реагентов и больше времени для выполнения. Температуры отжига для каждого набора праймеров должны быть оптимизированы, чтобы работать правильно в пределах одной реакции, и с размерами ампликона. То есть, длина их пары оснований должна быть достаточно разной с целью образования отдельных полос при визуализации путем электрофореза в геле.
• Вложенная ПЦР : увеличивает специфичность амплификации ДНК, за счет уменьшения фона в связи с неспецифической амплификацией ДНК. Используются два набора праймеров в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для синтеза ДНК-продуктов, которые помимо намеченной цели, могут по-прежнему состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Продукты используются затем во второй ПЦР с набором праймеров, чьи сайты связывания полностью или частично отличаются от 3"-концов каждого из праймеров, использованных в первой реакции. Вложенная ПЦР часто наиболее успешна в специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем традиционная ПЦР, но она требует более подробных знаний о последовательностях-мишенях.
• ПЦР с перекрывающимися расширениями или сращивание перекрывающимися расширениями (SOE): методика генной инженерии, которая применяется для соединения двух или более фрагментов ДНК, которые содержат комплементарные последовательности. Используется для соединения частей ДНК, содержащие гены, регулирующие последовательности, или мутации; техника позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК.
• Количественная ПЦР (КПЦР): используется для измерения количества продукта ПЦР (обычно в режиме реального времени). Количественно измеряет начальные количества ДНК, кДНК или РНК. КПЦР широко применяется для определения наличия последовательности ДНК в образце, и числа ее копий в пробе. Количественная ПЦР в реальном времени имеет очень высокую степень точности. Методы QRT-PCR (или QF-PCR) используют флуоресцентные красители, такие как «Sybr Green», «EvaGreen» или флюорофор-содержащие ДНК-зонды, такие как «TaqMan», чтобы измерить количество амплифицированного продукта в реальном времени. Иногда упоминается под сокращением RT-PCR (ПЦР в реальном времени) или RQ-PCR. QRT-PCR или RTQ-PCR являются более подходящими сокращениями, так как RT-PCR обычно относится к ПЦР с обратной транскрипцией, часто используемой в сочетании с КПЦР.
• ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR): для увеличения числа копий ДНК из РНК. Обратная транскриптаза транскрибирует РНК в кДНК, которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. RT-PCR широко используется в профилировании экспрессии для выявления экспрессии гена или для определения последовательности РНК-транскрипта, включая сайты старта транскрипции и прекращения. Если известна геномная последовательность ДНК гена, RT-PCR может использоваться для отображения расположения экзонов и интронов в гене. 5"-конец гена (соответствующий сайту старта транскрипции), как правило, определяется RACE-PCR (быстрой амплификацией концов кДНК).
• ПЦР твердой фазы : охватывает несколько значений, в том числе «Амплификация Полонии» (где ПЦР колонии производятся на матрице геля, например), «Bridge ПЦР» (праймеры ковалентно связаны с твердой опорной поверхностью), традиционная ПЦР твердой фазы (где применяется «асимметричная ПЦР» в присутствии праймеров, несущих твердую опору с последовательностью, соответствующей одному из водных праймеров), и ПЦР усиленной твердой фазы (где традиционная ПЦР твердой фазы может быть улучшена за счет применения высоких Tm и вложенных праймеров с твердой опорой с вариантом приложения термического «этапа», чтобы способствовать образованию праймеров с твердой опорой).
• Термическая асимметричная чередующаяся ПЦР (TAIL-PCR): применяется с целью выделения неизвестной последовательности, следующей за известной последовательностью. В известной последовательности, TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с различными температурами отжига; дегенерат праймера используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности.
• Touchdown PCR (ступенчатая ПЦР): вариант ПЦР, направленный на уменьшение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере прогрессирования циклов ПЦР. Температура отжига на начальных циклах, как правило, на несколько градусов (3-5 ° C) выше Tm используемых праймеров, в то время как на более поздних циклах, температура на несколько градусов (3-5 ° C) ниже Tm праймеров. Более высокие температуры дают большую специфичность для связывания праймера, и более низкие температуры способствуют более эффективной амплификации из специфических продуктов, образующихся во время начальных циклов.
• PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может применяться на живых клетках.
• Универсальная быстрая прогулка по геному : для прогулки по геному и генетической дактилоскопии с использованием более специфических «двусторонних» ПЦР, чем традиционные "односторонние" подходы (с использованием только один ген-специфического праймера и одного общего праймера - что может привести к артефактному «шуму») в силу механизма, включающего образование структуры лассо. Упрощенными производными UFW являются «Lane RAGE» (лассо-зависимая вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), «5"RACE Lane» и «3"RACE Lane».
• In silico PCR (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) относится к вычислительным средствам, применяющимся для вычисления результатов теоретической полимеразной цепной реакции с помощью данного набора праймеров (зондов) для амплификации последовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома.

История ПЦР

В статье в «Journal of Molecular Biology» в 1971 г. Клеппе и его соавторов впервые описан метод с использованием ферментативного анализа с целью репликации короткой матрицы ДНК с праймерами в условиях пробирки. Тем не менее, это раннее проявление основного принципа ПЦР не получило много внимания, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году, как правило, приписывается Кэри Муллису.

Когда Муллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле, Калифорнии на «Cetus Corporation», одной из первых компаний биотехнологии. Там он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Муллис писал, что он задумал ПЦР во время езды вдоль шоссе Пасифик Кост однажды ночью в своем автомобиле. Он проигрывал в своем сознании новый способ анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда он осознал, что он вместо этого изобрел метод увеличения числа копий любого участка ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, обусловленной ДНК-полимеразой. В «Scientific American», Муллис резюмировал процедуру: «Начиная с одной молекулы генетического материала ДНК, ПЦР может генерировать 100 млрд. подобных молекул за один день. Эту реакцию легко выполнить. Она требует не больше, чем пробирку, несколько простых реагентов и источник тепла». Он был награжден Нобелевской премией по химии в 1993 году за свое изобретение, семь лет спустя как он и его коллеги в «Cetus» впервые осуществили его предложение на практике. Тем не менее, остались некоторые противоречия об интеллектуальном и практическом вкладе других ученых в работе Муллиса, и был ли он единственным изобретателем принципа ПЦР.

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы, способной выдерживать высокие температуры> 90°C (194°F), необходимых для расщепления двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации. ДНК-полимеразы, первоначально использовавшиеся для экспериментов в пробирке, предвещая ПЦР, были не в состоянии выдержать такие высокие температуры. Поэтому, ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективны и занимали много времени, а также требовали большого количества ДНК-полимеразы и непрерывной обработки в течение всего процесса.

Открытие в 1976 г. Taq-полимеразы - полимеразы ДНК, выделенной из термофильной бактерии, Thermus aquaticus , которая, естественно, живет в горячих (от 50 до 80°C (122 до 176°F)) средах, таких как горячие источники - проложило путь к кардинальному улучшению метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из Т. Aquaticus , стабильна при высоких температурах и остается активной даже после денатурации ДНК, тем самым устраняя необходимость добавления новых ДНК-полимераз после каждого цикла. Это позволило автоматизировать процесс амплификации ДНК на основе амплификатора-термоциклера.

Патентные войны

Предложенный метод ПЦР был запатентован Кэри Муллисом и приписан «Cetus Corporation», где работал Муллис, когда он изобрел методику в 1983 году. Фермент Taq-полимераза был также защищен патентами. Было подано несколько громких исков, связанных с методикой, в том числе безуспешный иск, поданный «DuPont». Фармацевтическая компания «Hoffmann-La Roche» приобрела права на патенты в 1992 году и в настоящее время держит те, которые по-прежнему защищены.

Подобное патентное сражение за фермент Taq-полимеразу все еще продолжается в некоторых юрисдикциях по всему миру между «Roche» и «Promega». Правовые аргументы вышли за рамки сроков действия исходных патентов на ПЦР и Taq-полимеразу, срок действия которых истек 28 марта 2005 года.

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

В каких областях медицины применяется этот метод?

• Выделять и клонировать гены.
• Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
• Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.

На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

• В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии , туберкулёза .
• В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза , хламидиоза , микоплазменной инфекции , гарднереллеза , герпеса , гонореи .
• В гастроэнтерологической практике.
• В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции .
• В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты , дифтерия , сальмонеллёз .

В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ , венерических заболеваний , туберкулёза, клещевого энцефалита ).

Что происходит во время протекания реакции?

Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.

Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация ) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК ) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.

Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.

Существует:

• Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК ), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
• Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.

Спустя тридцать - сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.

Для амплификации in vitro (в пробирке ) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя ). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Какие преимущества имеет данная диагностика?

• Универсальность: для этого метода подходят любые образцы нуклеиновой кислоты.
• Высокая специфичность: возбудитель имеет уникальные последовательности цепочек ДНК, которые свойственны именно ему. Поэтому результаты проведённой ПЦР будут достоверными, в них невозможно спутать ген одного возбудителя с геном другого возбудителя.
• Чувствительность к наличию даже единичной молекулы возбудителя.

• Маленький объем материала, нужного для исследования. Подойдет даже капля крови. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неонатологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.
• Возможность определения вялотекущей, хронической инфекции, а не только острой.
• Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве.

Какие недостатки имеет данная диагностика?

• Если в материале, предназначенном для проведения ПЦР, находится ДНК не только живого возбудителя, но и погибшего – будет происходить амплификация обеих ДНК. Соответственно, лечение после диагностики может быть назначено не совсем верное. Через некоторое время лучше пройти контроль эффективности проведённого лечения.
• Повышенная чувствительность к наличию микроорганизмов тоже может считаться, в некотором роде, недостатком. Ведь в норме в человеческом организме присутствует условно-патогенная микрофлора, то есть это микроорганизмы, которые живут в кишечнике , желудке , других внутренних органах. Эти микроорганизмы могут принести вред человеку только при определенных неблагоприятных условиях – несоблюдение гигиенических требований, загрязненная питьевая вода и т.д. ПЦР-методика амплифицирует ДНК даже этих микроорганизмов, хотя они и не приводят к патологии.
• ПЦР разных тест-систем может показывать результаты, которые будут разниться между собой. Существует много модификаций данной методики: «вложенная », «ассиметричная », «инвертированная », «количественная » ПЦР и другие.