Faze PCR dijagnostike. Principi PCR dijagnostike. Trebam pomoć oko teme

Bakterijska genetika. Informacije za drugu lekciju.

lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimerazom je metoda koja omogućuje višestruko povećanje (amplifikaciju) broja određenih molekula DNA u analiziranom uzorku (uključujući biološki materijal ili čistu kulturu).

Glavne prednosti PCR-a kao dijagnostičke metode u mikrobiologiji su njegova vrlo visoka osjetljivost, koja omogućuje detekciju iznimno niskih koncentracija patogena u uzorcima, kao i prilagodljiva specifičnost, koja omogućuje detekciju ili identifikaciju patogena na generičkoj, vrsti. , ili razini podvrste. Glavni nedostatak PCR-a proizlazi iz njegove iznimno visoke osjetljivosti - slike vrlo lako mogu kontaminirati DNK iz pozitivne kontrole, drugog uzorka ili PCR proizvoda, što dovodi do lažno pozitivne reakcije. Ovo nameće stroga ograničenja na uvjete pod kojima se PCR miješa i obrađuje s gotovim PCR proizvodima.

Provođenje PCR-a. Priprema se reakcijska smjesa koja sadrži sljedeće komponente:

izolirani DNK iz uzorka za testiranje,

puferska otopina,

Mg2+ ioni (potrebni za rad enzima),

Dvije početnice su jednolančane kratke molekule DNA (najčešće duljine 18 do 24 nukleotida) komplementarne krajevima različitih niti sekvence DNA koju treba detektirati.

Smjesa deoksinukleotid trifosfata.

DNA polimeraza otporna na toplinu (najčešće korištena je Taq polimeraza, polimeraza izolirana iz Termus aquaticus).

Zatim se ova reakcijska smjesa stavlja u ciklor, koji je zapravo programabilni termostat. U cikleru se provodi 30-40 ciklusa promjena temperature. Svaki od ovih ciklusa sastoji se od tri faze (vidi sliku 1):

Denaturacija (temperatura 94 ° C) - lanci vodika se prekidaju, a lanci DNK se razilaze.

Žarenje primera (temperatura je obično u području od 50-60 °C) - primeri su pričvršćeni na krajeve DNA lanaca. Općenito, kada se temperatura snizi, ponovno ujedinjenje izvornih DNA lanaca iz uzorka koji se proučava (renaturacija) je energetski povoljnije, međutim, koncentracija početnica u reakcijskoj smjesi mnogo je redova veličine veća od koncentracije DNA. iz uzorka (barem u početnim PCR ciklusima), tako da reakcija žarenja početnica teče brže od renaturacije.DNA. Temperatura žarenja odabire se ovisno o temperaturama taljenja (denaturacije) primera.

Elongacija (temperatura je obično 72 °C) - DNA polimeraza dovršava početnice duž predloška dugih DNA lanaca. Temperatura odgovara optimalnoj radnoj temperaturi za korištenu DNA polimerazu.

Detekcija rezultata razlikuje se u različitim PCR formulacijama i opisana je u odjeljku "PCR varijeteti".

Dinamika PCR

U ranim PCR ciklusima, broj dvolančanih molekula DNA, čija je veličina određena udaljenošću između mjesta početnica, udvostručuje se sa svakim ciklusom. Također se stvara mali broj duljih molekula DNA, što se može zanemariti (vidi sliku 2).

Dakle, u ranim ciklusima, količina PCR produkta opisuje se formulom m*2 n, gdje je m početna količina željene DNA u uzorku, n je broj ciklusa. Tada reakcija dostiže plato. To je zbog nakupljanja produkta reakcije, smanjenja koncentracije početnica i deoksinukleotid trifosfata, a također i zbog povećanja koncentracije pirofosfata (vidi sliku 3).

Vrste PCR

Konvencionalni PCR

U ovoj verziji PCR postavke, reakcija se odvija unaprijed odabrani broj ciklusa (30-40), nakon čega se analizira je li došlo do nakupljanja dvolančanih molekula DNA u reakcijskoj smjesi.

Ova varijanta PCR-a, kada se koristi kao dijagnostička metoda, je kvalitativna metoda. Pozitivna reakcija ukazuje na prisutnost barem tragova željenih DNA molekula u uzorku. Negativna reakcija ukazuje na njihovu odsutnost. Kvantitativna procjena sadržaja inicijalnih molekula DNA u uzorku nije moguća jer reakcija dostiže plato.

Glavna metoda za otkrivanje prisutnosti produkta je elektroforeza u agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. PCR produkti se odvajaju u gelu pod djelovanjem električnog polja prema njihovoj molekulskoj masi. U gel se dodaje interkalacijska boja (fluorescentna u stanju povezanom s dvolančanom DNA – najčešće etidijev bromid). Dakle, kada se izloži ultraljubičastom svjetlu, bit će moguće vidjeti prisutnost ili odsutnost trake koja odgovara DNK potrebne molekularne težine. Kod provođenja PCR-a u dijagnostičke svrhe uvijek se postavljaju kontrole pozitivne i negativne reakcije s kojima se uspoređuju uzorci (vidi sliku 4).

real time PCR

U ovoj verziji PCR postavke, količina PCR produkta u reakcijskoj smjesi stalno se bilježi tijekom reakcije. To vam omogućuje da izgradite krivulju reakcije (vidi sliku 3) i na temelju nje izračunate broj željenih molekula DNK u uzorcima.

Jedna od vrsta PCR-a u stvarnom vremenu je korištenje interkalirajuće boje koja se dodaje izravno u reakcijsku smjesu (najčešće se koristi SYBRGreen). Drugi tip koristi jednu od vrsta fluorescentnih sondi koje se vežu na mjesto unutar PCR produkta, što omogućuje povećanje specifičnosti detekcije (vidi sliku 5).Fluorescencijska detekcija događa se izravno u uređaju tijekom reakcije.

Osim mogućnosti kvantitativne detekcije, postoje i druge prednosti PCR-a u stvarnom vremenu u usporedbi s konvencionalnim PCR-om. Ova PCR varijanta je jednostavnija, brža i ne zahtijeva otvaranje epruveta s PCR produktima, čime se smanjuje mogućnost kontaminacije drugih uzoraka. Glavni nedostatak je viša cijena pojačala s ugrađenom mogućnošću detekcije fluorescencije u usporedbi s konvencionalnim.

Digitalni kvantitativni PCR

Nova, skupa i još uvijek nedovoljno korištena inačica PCR-a, koja omogućuje točnije određivanje količine DNA u uzorku. U ovoj inačici, reakcijska smjesa koja sadrži fluorescentnu boju dijeli se na veliki broj mikroskopskih volumena (npr. , kapljice u emulziji). Nakon PCR-a analizira se u kojem se omjeru kapljica reakcija pokazala pozitivnom te se sukladno tome uočava fluorescencija. Taj će omjer biti proporcionalan broju DNA molekula od interesa u uzorku.

reverzna transkripcija PCR

U ovom slučaju, prije jedne ili druge PCR varijante, provodi se reakcija reverzne transkripcije (RNK u DNK) pomoću reverznog enzima. Dakle, ova metoda omogućuje kvalitativnu ili kvantitativnu detekciju RNA molekula. To se može koristiti za otkrivanje virusa koji sadrže RNA ili za određivanje razine transkripcije (količine mRNA) određenog gena.

Slika 1. PCR koraci. Primeri su označeni crvenom bojom.

Slika 2. Akumulacija dvolančanih DNA molekula ograničenih početnicima tijekom PCR-a.

Slika 3 Dinamika PCR reakcije pri različitim početnim koncentracijama željenih DNA molekula u uzorku. (a) - najveća koncentracija (b) - srednja koncentracija (c) - najniža koncentracija

Slika 4 Agarozna elektroforeza PCR proizvoda. K+ - pozitivna kontrola (očito je prisutna potrebna DNA). 1-7 - ispitni uzorci (od kojih su 1-2 pozitivni, 3-7 negativni). K- -negativna kontrola (definitivno nedostaje željena DNA). U mnogim slučajevima, osim ciljnog produkta, vidljivi su i svjetliji produkti nespecifične reakcije (primer-dimeri).

Slika 5 Metode detekcije pomoću PCR-a u stvarnom vremenu. (a) - interkalacijska boja - fluorescira kada se veže na dvolančanu DNA (b) - Taqmanova sonda - fluorescencija nastaje kada se sonda cijepa DNA polimerazom s 5'-3' endonukleaznom aktivnošću zbog odvajanja fluorofora i gasitelja. (c) MolecularBeacon sonda - fluorescencija se javlja kada se sonda hibridizira s ciljanim fragmentom zbog prostornog odvajanja fluorofora i gasitelja (d) - LightCycler sonde - akceptorska fluorescencija se javlja kada se sonde (koje sadrže akceptor i donor) hibridiziraju s metom fragment zbog prijenosa rezonantne fluorescentne energije (FRET).

Za odgovarajuće i učinkovito liječenje puno zarazne bolesti potrebno je pravovremeno postavljanje točne dijagnoze. U rješavanju ovog problema danas su uključene visokotehnološke dijagnostičke metode temeljene na metodama molekularne biologije. Trenutno se lančana reakcija polimerazom (PCR) već naširoko koristi u praktičnoj medicini kao najpouzdanije laboratorijsko dijagnostičko sredstvo.

Što objašnjava popularnost PCR-a u današnje vrijeme?

Drugo, pratiti učinkovitost liječenja.

U raznim priručnicima, prospektima, člancima, kao i objašnjenjima liječnika specijalista često se susrećemo s korištenjem nerazumljivih pojmova i riječi. Doista je teško govoriti o visokotehnološkim proizvodima znanosti običnim riječima.

Što je bit i mehanika PCR dijagnostike?

PCR dijagnostika je genetska studija biomaterijala.

Pozabavimo se terminologijom, što je to - DNK itd. Svaka stanica bilo kojeg živog bića (životinja, biljka, čovjek, bakterija, virus) ima kromosome. Kromosomi su čuvari genetskih informacija koje sadrže cijeli niz gena svakog pojedinog živog bića.

Svaki se kromosom sastoji od dva lanca DNA koji su međusobno upleteni u spiralu. DNK je po kemijskom sastavu dezoksiribonukleinska kiselina koja se sastoji od strukturnih komponenti – nukleotida. Postoji 5 vrsta nukleotida - timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C) i uracil (U). Nukleotidi su poredani jedan za drugim u strogom individualnom nizu, tvoreći gene. Jedan gen se može sastojati od 20-200 takvih nukleotida. Na primjer, gen koji kodira proizvodnju inzulina dugačak je 60 parova baza.

Nukleotidi imaju svojstvo komplementarnosti. To znači da se nasuprot adenina (A) u jednom lancu DNA uvijek nalazi timin (T) u drugom lancu, a nasuprot gvanina (G) - citozin (C). Shematski izgleda na sljedeći način:
G - C
T - A
A - T
Ovo svojstvo komplementarnosti je ključno za PCR.

Osim DNK, istu strukturu ima i RNK – ribonukleinska kiselina, koja se od DNK razlikuje po tome što umjesto timina koristi uracil. RNA - je čuvar genetske informacije u nekim virusima, koji se nazivaju retrovirusi (na primjer, HIV).

Molekule DNA i RNA mogu se "množiti" (ovo se svojstvo koristi za PCR). To se događa na sljedeći način: dvije niti DNA ili RNA odmiču jedna od druge u stranu, na svakoj niti sjedi poseban enzim koji sintetizira novi lanac. Sinteza se odvija prema principu komplementarnosti, odnosno ako je nukleotid A u izvornom lancu DNA, tada će T biti u novosintetiziranom, ako je G - onda C itd. Ovaj posebni enzim "graditelj" treba "sjeme" - niz od 5-15 nukleotida - da bi započeo sintezu. Ovo "sjeme" definirano je za svaki gen (gen klamidije, mikoplazma, virusi) eksperimentalno.

Dakle, svaki PCR ciklus se sastoji od tri faze. U prvoj fazi dolazi do takozvanog odmotavanja DNK – odnosno do odvajanja dvaju međusobno povezanih lanaca DNK. U drugom, "sjeme" je pričvršćeno na dio DNK lanca. I, na kraju, produljenje tih DNK lanaca, koje proizvodi enzim "graditelj". Trenutačno se cijeli ovaj složeni proces odvija u jednoj epruveti i sastoji se od ponovljenih ciklusa reprodukcije DNK koja se određuje kako bi se dobio veliki broj kopija koje se zatim mogu detektirati konvencionalnim metodama. Odnosno, iz jednog lanca DNK dobijemo stotine ili tisuće.

Faze PCR studije

Prikupljanje biološkog materijala za istraživanje

Potrebni reagensi dodaju se uzetim uzorcima i stavljaju u programabilni termostat – termocikler (pojačivač). U cikleru se PCR ciklus ponavlja 30-50 puta, a sastoji se od tri faze (denaturacija, žarenje i elongacija). Što to znači? Razmotrimo detaljnije.

Faze neposredne PCR reakcije, kopiranje genetskog materijala

ja

„Sjemenke“ industrijski proizvode razne istraživačko-proizvodne udruge, a laboratoriji kupuju već gotove. U isto vrijeme, "sjeme" za otkrivanje, na primjer, klamidije, radi samo za klamidiju itd. Dakle, ako se biomaterijal testira na prisutnost klamidijske infekcije, tada se "sjeme" za klamidiju stavlja u reakcijsku smjesu; ako se testira biomaterijal na Epstein-Barr virus, onda "sjeme" na Epstein-Barr virus.

IIstadij - Kombinacija genetskog materijala uzročnika infekcije i "sjemena".
Ako postoji DNK virusa ili bakterije koju treba odrediti, "sjeme" se nalazi na toj DNK. Ovaj proces dodavanja primera drugi je korak PCR-a. Ova faza odvija se na temperaturi od 75°C.

IIIstadij - Kopiranje genetskog materijala uzročnika infekcije.
To je proces stvarne elongacije ili reprodukcije genetskog materijala, koji se odvija na 72°C. Graditelj enzima prilazi "sjemenu" i sintetizira novi lanac DNK. Završetkom sinteze novog DNA lanca završava i PCR ciklus. Odnosno, u jednom PCR ciklusu količina genetskog materijala se udvostruči. Primjerice, u početnom uzorku bilo je 100 DNA molekula virusa, nakon prvog PCR ciklusa u uzorku će biti već 200 DNA molekula testiranog virusa. Jedan ciklus traje 2-3 minute.

Kako bi se stvorilo dovoljno genetskog materijala za identifikaciju, obično se provodi 30-50 PCR ciklusa, što traje 2-3 sata.

Faza identifikacije razmnoženog genetskog materijala

Danas je pomoću označenih "sjemena", kao i odgovarajućeg softvera, moguće odmah "očitati" rezultate PCR-a. Ovo je takozvani PCR u realnom vremenu.

Zašto je PCR dijagnostika toliko vrijedna?

Jedna od značajnih prednosti PCR metode je njena visoka osjetljivost - od 95 do 100%. Međutim, te se prednosti moraju temeljiti na neizostavnom poštivanju sljedećih uvjeta:

1. ispravno uzimanje uzoraka, transport biološkog materijala;
2. dostupnost sterilnih, jednokratnih instrumenata, posebnih laboratorija i obučenog osoblja;
3. strogo pridržavanje metodologije i sterilnost tijekom analize

Mogućnosti svojstvene PCR analizi omogućuju postizanje nenadmašne analitičke specifičnosti. To znači identificirati točno onaj mikroorganizam koji je tražen, a ne sličan ili blisko povezan.
Dijagnostička osjetljivost i specifičnost PCR metode često premašuje one kulture metode, koja se naziva "zlatnim standardom" za otkrivanje zaraznih bolesti. S obzirom na trajanje rasta kulture (od nekoliko dana do nekoliko tjedana), prednost PCR metode postaje očita.

PCR u dijagnostici infekcija
Prednosti PCR metode (osjetljivost i specifičnost) određuju širok raspon primjene u moderna medicina.
Glavna područja primjene PCR dijagnostike:

1. dijagnoza akutnih i kroničnih zaraznih bolesti različite lokalizacije
2. praćenje učinkovitosti terapije
3. pojašnjenje vrste patogena

Korištenje PCR dijagnostike provodi se zajedno s drugim metodama istraživanja (ELISA, PIF, RIF, itd.). Njihovu kombinaciju i svrsishodnost određuje liječnik.

Uzročnici infekcije otkriveni PCR-om

Virusi:

1. HIV-1 i HIV-2 retrovirusi
2. herpetiformni virusi
3. herpes simplex virus tipa 1 i 2

Lančana reakcija polimerazom (PCR)- eksperimentalna metoda molekularne biologije, koja je specifična amplifikacija nukleinskih kiselina inducirana sintetskim oligonukleotidnim početnicama in vitro.

Ideja o razvoju PCR metode pripada američkom istraživaču Karyu Mullisu, koji je 1983. godine stvorio metodu koja je omogućila umnožavanje DNK tijekom cikličkih udvostručenja pomoću enzima DNK polimeraze u umjetnim uvjetima. Nekoliko godina nakon objave te ideje, 1993. K. Mullis je za nju dobio Nobelovu nagradu.

Na početku primjene metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja-hlađenja, u reakcijsku smjesu bilo je potrebno dodati DNA polimerazu, jer se ona brzo inaktivirala na visokoj temperaturi. Postupak je bio vrlo neučinkovit, zahtijevao je puno vremena i enzima. Godine 1986. značajno je modificiran korištenjem DNA polimeraze iz termofilnih bakterija. Ovi enzimi mogu izdržati mnoge reakcijske cikluse, što vam omogućuje automatizaciju PCR-a. Jedna od najčešće korištenih termostabilnih DNA polimeraza izolirana je iz bakterija. Thermus aquaticus i imenovani Taq-DNA polimeraza.

Suština metode. Metoda se temelji na višestrukom selektivnom kopiranju određene regije DNA pomoću enzima Taq-DNA polimeraze. Lančana reakcija polimeraze omogućuje dobivanje amplifikacija duljine do nekoliko tisuća parova baza. Za povećanje duljine PCR produkta na 20-40 tisuća parova baza koristi se mješavina raznih polimeraza, ali to je još uvijek puno manje od duljine kromosomske DNA eukariotske stanice.

Reakcija se provodi u programabilnom termostatu (pojačalu) - uređaju koji može izvesti dovoljno brzo

hlađenje i zagrijavanje epruveta (obično s točnošću od najmanje 0,1 °C). Pojačala vam omogućuju postavljanje složenih programa, uključujući one s mogućnošću "vrućeg pokretanja" i naknadne pohrane. Za PCR u stvarnom vremenu proizvode se uređaji opremljeni fluorescentnim detektorom. Instrumenti su također dostupni s automatskim poklopcem i odjeljkom za mikropločice, što im omogućuje integraciju u automatizirane sustave.

Obično se tijekom PCR-a provodi 20-45 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze: denaturacije, žarenja primera, elongacije (sl. 6.1 i 6.2). Na sl. 6.1 prikazuje dinamiku promjena temperature u epruveti tijekom PCR ciklusa.

Riža. 6.1. Grafikon promjene temperature u epruveti tijekom jednog ciklusa lančane reakcije polimerazom

Denaturacija šablona DNK provodi se zagrijavanjem reakcijske smjese na 94-96 °C tijekom 5-90 s tako da se lanci DNA rasprše. Treba napomenuti da se prije prvog ciklusa reakcijska smjesa prethodno zagrijava 2-5 minuta kako bi se u potpunosti denaturirala početna matrica, što omogućuje smanjenje količine nespecifičnih produkata reakcije.

Riža. 6.2. Shema prvog ciklusa lančane reakcije polimeraze

Faza žarenja temeljnog premaza. S postupnim smanjenjem temperature, primeri se komplementarno vežu na predložak. Temperatura žarenja ovisi o sastavu temeljnih premaza i obično je 4-5°C niža od izračunate temperature taljenja. Trajanje faze je 5-60 s.

Tijekom sljedeće faze - produljenje- dolazi do sinteze DNA lanca kćeri na majčinoj matrici. Temperatura elongacije ovisi o polimerazi. Često korištene Taq i Pfu DNA polimeraze najaktivnije su na 72°C. Vrijeme elongacije, uglavnom ovisno o duljini PCR produkta, tipično je 1 minuta na 1000 parova baza.

Lančana reakcija polimerazom (PCR)- je metoda biokemijske tehnologije u molekularnoj biologiji, koja se provodi s ciljem povećanja jedne ili više kopija fragmenata DNA za nekoliko stupnjeva, što vam omogućuje stvaranje od nekoliko tisuća do milijuna kopija određene sekvence DNA.

Razvio 1983. godine Cary Mullis, PCR metoda je danas uobičajena i često nezamjenjiva metoda koja se koristi u medicinskim i biološkim istraživačkim laboratorijima za mnoge različite primjene. To uključuje kloniranje DNK za sekvenciranje, filogeniju temeljenu na DNK ili funkcionalnu analizu gena; dijagnostika nasljedne bolesti; identifikacija genetskih otisaka prstiju (koriste se u granama forenzičke znanosti i kod utvrđivanja očinstva), kao i otkrivanje i dijagnosticiranje zaraznih bolesti. Godine 1993. Mullis je zajedno s Michaelom Smithom dobio Nobelovu nagradu za kemiju za njihov rad na PCR-u.

Metoda se temelji na toplinskom ciklusu, koji se sastoji od ponovljenih ciklusa reakcija zagrijavanja i hlađenja za denaturaciju i replikaciju DNK pomoću enzima. Primeri, (kratki dijelovi DNK) koji sadrže sekvence koje su komplementarne ciljnom mjestu zajedno s DNK polimerazom (po kojoj je metoda dobila naziv), ključne su komponente za pokretanje selektivne i ponovne amplifikacije. U procesu PCR, sama sintetizirana DNA koristi se kao predložak za replikaciju, čime se pokreće lančana reakcija u kojoj se predložak DNA eksponencijalno umnožava. PCR se može značajno modificirati za izvođenje širokog spektra genetskih manipulacija.

Gotovo sve PCR aplikacije koriste termostabilnu DNA polimerazu kao što je Taq polimeraza, enzim izvorno izoliran iz bakterija. Termusaquaticus. Ova DNA polimeraza enzimatski sastavlja novi lanac DNA od građevnih blokova DNA - nukleotida, koristeći jednolančanu DNA kao predložak i DNA oligonukleotide (koji se nazivaju i DNA početnice) koji su potrebni za pokretanje sinteze DNA. Velika većina PCR metoda koristi termalni ciklus, tj. naizmjenično zagrijavanje i hlađenje PCR uzorka tijekom određenog niza temperaturnih koraka. Ovi koraci toplinskog ciklusa prvo su potrebni za fizičko odvajanje dvaju lanaca dvostruke spirale DNK na visokoj temperaturi u procesu koji se naziva denaturacija DNK. Na nižoj temperaturi, svaki lanac će se koristiti kao predložak u sintezi DNA pomoću DNA polimeraze kako bi se selektivno pojačala ciljna regija DNA. Selektivnost rezultata PCR-a upotrebom početnica koje su komplementarne ciljnoj regiji DNK za umnožavanje pod određenim uvjetima toplinskog ciklusa.

Principi PCR dijagnostike

PCR se koristi za umnožavanje specifičnog dijela lanca DNK (ciljane DNK). Većina PCR metoda obično pojačava fragmente DNA do ~10 000 parova baza (kb), iako neke metode dopuštaju povećanje veličine fragmenata do 40 kb. Reakcija proizvodi ograničenu količinu konačnog amplificiranog produkta, koji je kontroliran dostupnim reagensima u reakciji i povratnom inhibicijom produkata reakcije.

Osnovni PCR komplet zahtijeva nekoliko komponenti i reagensa. To uključuje:

• DNK predložak, koji sadrži ciljnu regiju DNA koju treba umnožiti.
• dva primera, komplementarni s 3' krajevima svakog od smislenih i antisense lanaca ciljne DNA.
• Taq polimeraza ili drugu DNA polimerazu koja radi na optimalnoj temperaturi od oko 70°C.
• Deoksinukleozidni trifosfati(dNTPs; trifosfatne skupine koje sadrže nukleotide), građevni blokovi iz kojih DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac.
• puferska otopina, osiguravajući odgovarajuće kemijske uvjete za optimalnu aktivnost i stabilnost DNA polimeraze.
• dvovalentni kationi, ioni magnezija ili mangana; Mg2+ se obično koristi, ali Mn2+ se također može koristiti za mutagenezu DNA posredovanu PCR-om, budući da veće koncentracije Mn2+ povećavaju stopu pogreške tijekom sinteze DNA.
• Jednovalentni kationi ioni kalija.

PCR se obično provodi u reakcijskom volumenu od 10-200 µl u malim reakcijskim epruvetama (volumena 0,2-0,5 ml) u termocikleru-pojačivaču. Cikler zagrijava i hladi reakcijske cijevi kako bi se postigle temperature potrebne za svaki korak reakcije. Mnogi moderni cikleri koriste Peltierov učinak, koji omogućuje zagrijavanje i hlađenje sklopa PCR cijevi jednostavnim mijenjanjem smjera električne struje. Reakcijske cijevi tankih stijenki potiču povoljnu toplinsku vodljivost kako bi se osigurala brza toplinska ravnoteža. Stariji cikleri koji nemaju grijani poklopac zahtijevaju sloj ulja na površini reakcijske smjese ili zrnca voska u bočici.

Redoslijed postupka

Tipično, PCR se sastoji od niza od 20-40 ponovljenih promjena temperature koje se nazivaju ciklusi, pri čemu se svaki ciklus obično sastoji od 2-3 diskretna temperaturna koraka, obično tri. Ciklusiranje često počinje i završava jednim temperaturnim korakom (tzv predviđanje) na visokoj temperaturi (> 90 °C) za konačnu ekspanziju proizvoda ili kratko skladištenje. Korištene temperature i trajanje njihove primjene u svakom ciklusu ovise o mnogim parametrima. To uključuje enzim koji se koristi za sintezu DNA, koncentraciju dvovalentnih iona i dNTP u reakciji i točku taljenja (Tm) početnica.

• Faza inicijalizacije: Ovaj korak sastoji se od zagrijavanja reakcije na temperaturu od 94-96°C (ili 98°C ako se koriste visoko toplinski stabilne polimeraze), koje se provodi 1-9 minuta. Korak je potreban samo za DNA polimeraze koje zahtijevaju toplinsku aktivaciju, takozvani hot start PCR.
• Korak denaturacije: To je prvi redoviti događaj toplinskog ciklusa i sastoji se od zagrijavanja reakcije na 94-98°C tijekom 20-30 sekundi. To uzrokuje cijepanje predloška DNA s razaranjem vodikovih veza između komplementarnih baza i stvaranjem jednolančanih molekula DNA.
• Korak žarenja: Reakcijska temperatura se smanji na 50-65°C tijekom 20-40 sekundi, što omogućuje vezivanje početnica na jednolančanu DNA šablonu. Tipično je temperatura žarenja oko 3-5 stupnjeva Celzijusa ispod Tm korištenih primera. Stabilne vodikove veze DNA-DNA nastaju samo kada sekvenca primera više odgovara šabloni sekvence. Polimeraza se veže na hibrid početnica i šablona i inicira sintezu DNA.
• Faza širenja/produženja: Temperatura tijekom ovog koraka ovisi o korištenoj DNA polimerazi; Taq polimeraza ima svoju optimalnu temperaturu aktivnosti na 75-80°C; za ovaj enzim obično se koristi temperatura od 72°C. U ovoj fazi, DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac komplementaran DNA šablonskom lancu dodavanjem dNTP-a koji su komplementarni s predloškom u smjeru od 5" do 3", povezujući 5"-fosfatnu skupinu dNTP-a s 3"-hidroksilnom skupinom. na kraju rezultirajuće (šireće) DNA. Vrijeme ekspanzije ovisi i o korištenoj DNA polimerazi i o duljini fragmenta DNA koji treba umnožiti. Tipično, na svojoj optimalnoj temperaturi, DNA polimeraza polimerizira tisuću baza u minuti. Pod optimalnim uvjetima, tj. u nedostatku ograničenja zbog ograničavajućih supstrata ili reagensa, u svakom koraku ekspanzije, količina ciljne DNA se udvostručuje, što rezultira eksponencijalnom (geometrijskom) amplificiranjem fragmenta DNA.
• Završno proširenje: Ovo je jedini korak, koji se ponekad izvodi na 70-74°C 5-15 minuta nakon posljednjeg PCR ciklusa, kako bi se osiguralo da se preostala jednolančana DNK u potpunosti produžila.
• Konačno očekivanje: Ovaj korak na 4-15 °C na neodređeno vrijeme može se koristiti kako bi reakcija bila kratka. Kako bi se provjerilo je li PCR sintetizirao očekivani fragment DNA (također se ponekad naziva "amplimer" ili "amplicon"), koristi se elektroforeza u agaroznom gelu za odvajanje PCR proizvoda po veličini. Veličina PCR proizvoda određena je usporedbom s DNA ljestvama (marker molekularne težine) koji sadrži DNA fragmente poznate veličine, a koja se izvodi na gelu zajedno s PCR produktima.

Faze lančane reakcije polimeraze

PCR proces se može podijeliti u tri koraka:

1. Eksponencijalno pojačanje: Tijekom svakog ciklusa, količina proizvoda se udvostručuje (pod pretpostavkom 100% učinkovitosti reakcije). Reakcija je vrlo osjetljiva: potrebna je samo mala količina DNK.
2. Faza izravnavanja: reakcija se usporava kako DNA polimeraza gubi aktivnost, a potrošnja reagensa kao što su dNTP i početnice uzrokuje njihovo ograničavanje .
3. Plato: Proizvod se više ne nakuplja zbog iscrpljivanja reagensa i enzima.

PCR optimizacija

U praksi PCR može biti neuspješan iz različitih razloga, posebice zbog svoje osjetljivosti na kontaminaciju, koja uzrokuje umnožavanje nusproizvoda DNA. U tom smislu, razvijen je niz tehnika i postupaka za optimizaciju uvjeta PCR. Kontaminacija stranom DNK rješava se laboratorijskim protokolima i postupcima koji pročišćavaju mješavine prije PCR od potencijalnih kontaminanata DNK. To obično uključuje odvajanje PCR kompleta od područja za analizu ili pročišćavanje PCR proizvoda, korištenje jednokratnog plastičnog pribora i temeljito čišćenje radne površine između koraka reakcije. Tehnike dizajna primera igraju važnu ulogu u poboljšanju izolacije PCR proizvoda i u izbjegavanju stvaranja nusproizvoda, a upotreba alternativnih komponenti pufera ili enzima polimeraze može pomoći u pojačavanju dugih ili na drugi način problematičnih područja DNK. Dodavanje reagensa kao što je formamid puferskim sustavima može povećati specifičnost i oporavak PCR-a. Računalna simulacija teoretskih rezultata PCR-a (elektronički PCR) može se izvesti kao pomoć u dizajnu početnica.

Primjena PCR-a

Selektivna izolacija DNA

PCR omogućuje izolaciju fragmenata DNA iz genomske DNA selektivnim umnožavanjem specifične regije DNA. Ova primjena PCR-a nadopunjuje mnoge metode, kao što je stvaranje hibridizacijskih sondi za Southern ili Northern blotting i metode kloniranja DNA, koje zahtijevaju velike količine DNA koje predstavljaju određenu regiju DNA. PCR nudi ove metode visok sadržajčista DNA, koja omogućuje analizu uzoraka DNA, čak i s malom količinom početnog materijala.

Druge primjene PCR-a uključuju sekvenciranje DNA za identifikaciju nepoznatih sekvenci pojačanih PCR-om, u kojima se jedan od početnica za pojačanje može koristiti u Sanger sekvencioniranju, izolaciju sekvence DNA za ubrzavanje tehnologija rekombinantne DNA koje uključuju umetanje sekvence DNA u plazmid ili genetski materijal drugog organizma. Kolonije bakterija (E. coli) mogu se brzo pregledati PCR-om kako bi se ispravio vektorski dizajn DNK. PCR se također može koristiti za genetsko uzimanje otisaka; tehnika koja se koristi u sudskoj medicini za identifikaciju osobe ili organizma usporedbom eksperimentalne DNK korištenjem različitih PCR metoda.

Neke PCR metode "otiska prsta" imaju veliku diskriminatornu moć i mogu se koristiti za određivanje genetskih odnosa između pojedinaca, kao što su roditelj-dijete ili između braće i sestara, te se koriste u testiranju očinstva. Ova se tehnika također može primijeniti za određivanje evolucijskih odnosa između organizama.

Amplifikacija i kvantifikacija DNA

Budući da PCR povećava broj kopija ciljanih DNA regija, PCR se može koristiti za analizu vrlo malih količina uzorka. Ovo je često kritično za forenzičke istrage gdje su kao dokazi dostupni samo tragovi DNK. PCR se također može koristiti za analizu drevne DNK koja je stara nekoliko desetaka tisuća godina. Ove PCR metode uspješno su korištene na životinjama kao što je 40.000 godina star mamut, kao i na ljudskoj DNK, u različitim primjenama od analize egipatskih mumija do identifikacije ruskog cara.

Kvantitativne PCR metode procjenjuju količinu dane sekvence prisutne u uzorku, metoda koja se često koristi za kvantificiranje razine ekspresije gena. PCR u stvarnom vremenu je utvrđeni alat za kvantificiranje DNK koji mjeri nakupljanje DNK proizvoda nakon svakog ciklusa PCR amplifikacije.

PCR u dijagnostici bolesti

PCR omogućuje rana dijagnoza maligne bolesti, poput leukemije i limfoma, koji je trenutno vrlo razvijen u istraživanju raka i već se rutinski koristi. PCR se može provesti izravno na uzorcima genomske DNA za otkrivanje malignih stanica specifičnih za translokaciju s osjetljivošću koja je najmanje 10 000 puta veća od ostalih metoda.

PCR također omogućuje detekciju nekultiviranih ili sporo rastućih organizama kao što su mikobakterije, anaerobne bakterije i virusi iz kulture tkiva i životinjskih modela. Osnova PCR dijagnostičke primjene u području mikrobiologije je identifikacija uzročnika infekcije i razlikovanje nepatogenih sojeva od patogenih zbog specifičnih gena.

Virusna DNA također se može detektirati PCR-om. Početnice moraju biti specifične za ciljne DNK sekvence virusa, a PCR se može koristiti za dijagnostičke DNK testove ili sekvenciranje virusnog genoma. Visoka osjetljivost PCR-a omogućuje otkrivanje virusa ubrzo nakon infekcije, pa čak i prije početka bolesti. Ovo rano otkrivanje virusa moglo bi liječnicima dati značajne mogućnosti liječenja. Također se može odrediti količina virusa ("virusno opterećenje") u bolesnika kvantitativna metoda Analiza DNA temeljena na PCR.

Varijacije osnovnih metoda lančane reakcije polimerazom

• Alel-specifična PCR: dijagnostička metoda ili metoda kloniranja temeljena na polimorfizmima jednog nukleotida (SNP) (razlike jedne baze u DNA). Zahtijeva prethodno poznavanje sekvence DNA, uključujući razlike između alela, i koristi početnice čiji 3' krajevi obuhvaćaju SNP-ove. Stroga PCR amplifikacija mnogo je manje učinkovita u prisutnosti nepodudarnosti između predloška i početnice, tako da je uspješna amplifikacija s SNP-specifičnim početni signali o prisutnosti specifičnih SNP-ova u sekvenci.
• PCR sklop ili sklop polimeraze (PCP): umjetna sinteza dugih sekvenci DNA pomoću PCR-a na skupu dugih oligonukleotida s kratkim preklapajućim segmentima. Oligonukleotidi se izmjenjuju između smislenih i antisense smjerova niti, a segmenti koji se preklapaju određuju redoslijed PCR fragmenata, čime se selektivno stvara konačni produkt duge DNK.
• Asimetrični PCR: preferirano pojačava jedan lanac DNA u dvolančanoj DNA šabloni. Koristi se u ispitivanju sekvenciranja i hibridizacije gdje je potrebno pojačanje samo jednog od dva komplementarna lanca. PCR se provodi kao i obično, ali s velikim viškom početnica za lanac namijenjen umnožavanju. Zbog spore (aritmetičke progresije) amplifikacije na kraju reakcije nakon upotrebe ograničavajućeg početnica, potrebni su dodatni PCR ciklusi. Zadnja izmjena Ovaj proces, poznat kao "LATE-PCR" (linearnost nakon eksponencijalne faze - PCR) koristi ograničavajući primer s višom talištem (Tm) od viška primera za održavanje učinkovitosti reakcije, budući da se koncentracija ograničavajućeg primera smanjuje usred reakcija.
• Dial-out PCR: vrlo paralelna metoda za dobivanje preciznih molekula DNA za sintezu gena. Složeni skup molekula DNK modificiran je jedinstvenim bočnim oznakama u masivno paralelno sekvenciranje. Prajmeri usmjereni na oznaku zatim daju sekvencirane molekule pomoću PCR-a.
• Pojačanje ovisno o helikazi: sličan tradicionalnom PCR-u, ali zahtijeva konstantnu temperaturu nego ciklički ciklusi denaturacije i žarenja/ekspanzije. DNK helikaza, enzim koji odmotava DNK, koristi se umjesto toplinske denaturacije.
• Hot start PCR: tehnika koja smanjuje nespecifično pojačanje tijekom početna postavka PCR koraci. Može se obaviti ručno zagrijavanjem reakcijskih komponenti do temperature denaturacije (npr. 95 °C) prije dodavanja polimeraze. Razvijeni su specijalizirani enzimski sustavi koji inhibiraju aktivnost polimeraze na sobnoj temperaturi, bilo vezanjem protutijela ili u prisutnosti kovalentno vezanih inhibitora koji disociraju tek nakon koraka aktivacije na visokoj temperaturi. Vrući start/hladni završetak PCR-a postiže se novim hibridnim polimerazama koje su neaktivne na sobnoj temperaturi i trenutno se aktiviraju na temperaturi elongacije.
• Intermikrosatelitni sekvencijski specifični PCR (ISSR): PCR DNA metoda otiska prsta koja povećava broj kopija regija između jednostavnih sekvenci koje se ponavljaju kako bi se dobio jedinstveni otisak prsta iz duljine pojačanog fragmenta.
• Obrnuto PCRširoko se koristi za definiranje regija sekvenci oko genomskih umetaka. Uključuje niz cijepanja DNA i samoligacije, što rezultira poznatim sekvencama na oba kraja nepoznate sekvence.
• PCR posredovan ligacijom: Koristi male DNK poveznice povezane s DNK od interesa i nekoliko početnica povezanih s DNK poveznicama; koristi se za sekvenciranje DNK, hodanje genomom i DNK trag.
• PCR specifičan za metilaciju(MSP): Razvili su ga Stephen Bailin i Jim Herman na Medicinskom fakultetu Johns Hopkins, a koristi se za otkrivanje metilacije CpG otoka u genomskoj DNK. DNK se najprije tretira s natrijevim bisulfitom, koji pretvara nemetilirane citozinske baze u uracil, kojeg PCR početnice prepoznaju kao timin. Zatim se provode dva PCR-a na modificiranoj DNA korištenjem skupova identičnih početnica osim za bilo koji CpG otok unutar sekvence početnice. U tim točkama, jedan set početnica prepoznaje DNA s citozinima kako bi povećao broj kopija metilirane DNA, a jedan set prepoznaje DNA s uracilom ili timinom kako bi pojačao nemetiliranu DNA. MSP pomoću qPCR-a također se može provesti radi dobivanja kvantitativnih, a ne kvalitativnih informacija o metilaciji.
• Miniprimer - PCR: koriste se termostabilne polimeraze (S-Tbr), koje se mogu protezati od kratkih početnica ("smalligos"), s brojem od 9 ili 10 nukleotida. Ova tehnika omogućuje PCR-u da cilja regije povezane s manjim početnicama i koristi se za umnožavanje konzerviranih sekvenci DNA kao što je 16S (ili eukariotski 18S) rRNA gen.
• Amplifikacija sonde ovisna o multipleksnoj ligaciji (MLPA): omogućuje umnožavanje višestrukih ciljeva sa samo jednim parom početnica, čime se izbjegavaju ograničenja razlučivosti multipleksne PCR.
• Multiplex PCR sastoji se od nekoliko setova početnica u jednoj PCR smjesi za dobivanje amplikona različite veličine koji su specifični za različite sekvence DNK. Fokusiranjem na nekoliko gena u isto vrijeme, moguće je dobiti dodatne informacije tijekom jednog testa, koji bi inače zahtijevao nekoliko puta više reagensa i više vremena za dovršenje. Temperature žarenja za svaki set primera moraju biti optimizirane kako bi ispravno radile unutar jedne reakcije i s veličinama amplikona. To jest, njihova duljina para baza mora biti dovoljno različita da formiraju različite trake kada se vizualiziraju elektroforezom u gelu.
• Ugniježđeni PCR: povećava specifičnost amplifikacije DNA, smanjujući pozadinu zbog nespecifične amplifikacije DNA. Dva seta početnica koriste se u dva uzastopna PCR-a. U prvoj reakciji, jedan par početnica koristi se za sintezu DNA produkata, koji se osim namjene još mogu sastojati od nespecifično umnoženih fragmenata DNA. Produkti se zatim koriste u drugom PCR-u sa skupom početnica čija su vezna mjesta u potpunosti ili djelomično različita od 3' krajeva svake od početnica korištenih u prvoj reakciji. Ugniježđeni PCR često je uspješniji u specifičnom pojačavanju dugih fragmenata DNA od tradicionalni PCR, ali zahtijeva detaljnije poznavanje ciljnih sekvenci.
• PCR s preklapajućim nastavcima ili spajanje s preklapajućim nastavcima(SOE): Tehnika genetskog inženjeringa koja se koristi za spajanje dva ili više dijelova DNK koji sadrže komplementarne sekvence. Koristi se za povezivanje dijelova DNK koji sadrže gene koji reguliraju sekvence ili mutacije; tehnika omogućuje stvaranje specifičnih i dugih DNA konstrukata.
• Kvantitativni PCR (QPCR): koristi se za mjerenje količine PCR produkta (obično u stvarnom vremenu). Kvantificira početne količine DNA, cDNA ili RNA. qPCR se široko koristi za određivanje prisutnosti sekvence DNK u uzorku i broja njezinih kopija u uzorku. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu ima vrlo visok stupanj točnosti. Metode QRT-PCR (ili QF-PCR) koriste fluorescentne boje kao što su Sybr Green, EvaGreen ili DNA sonde koje sadrže fluorofore kao što je TaqMan za mjerenje količine umnoženog produkta u stvarnom vremenu. Ponekad se naziva RT-PCR (PCR u stvarnom vremenu) ili RQ-PCR. QRT-PCR ili RTQ-PCR prikladnije su kratice budući da se RT-PCR obično odnosi na PCR s obrnutom transkripcijom koji se često koristi u kombinaciji s qPCR-om.
• PCR obrnute transkripcije (RT-PCR): povećati broj kopija DNK iz RNK. Reverzna transkriptaza transkribira RNA u cDNA, koja se zatim umnožava PCR-om. RT-PCR se široko koristi u profiliranju ekspresije za otkrivanje ekspresije gena ili za određivanje sekvence RNA transkripta, uključujući mjesta početka i završetka transkripcije. Ako je poznata sekvenca genomske DNA gena, RT-PCR se može koristiti za mapiranje položaja egzona i introna u genu. 5' kraj gena (koji odgovara početnom mjestu transkripcije) obično se određuje pomoću RACE-PCR (brzo umnažanje cDNA krajeva).
• PCR čvrste faze: pokriva nekoliko značenja, uključujući "Polonia Amplification" (gdje se PCR kolonije izrađuju na gel matrici, na primjer), "Bridge PCR" (primeri su kovalentno vezani na čvrstu potpornu površinu), tradicionalni PCR na čvrstoj fazi (gdje "asimetrični PCR " koristi se u prisutnosti početnica koje nose krutu potporu sa sekvencom koja odgovara jednom od vodenih početnica) i poboljšane PCR krute faze (gdje se konvencionalna PCR krute faze može poboljšati korištenjem visokog Tm i ugniježđenih početnica krute potpore s mogućnost primjene toplinskog "koraka" za poticanje stvaranja temeljnih premaza uz čvrstu potporu).
• Termički asimetrični interleaved PCR (TAIL-PCR): koristi se za izolaciju nepoznate sekvence koja slijedi nakon poznate sekvence. U poznatom nizu, TAIL-PCR koristi ugniježđeni par primera s različitim temperaturama žarenja; degenerirani primer se koristi za pojačavanje u drugom smjeru od nepoznate sekvence.
• Touchdown PCR (Step PCR): PCR varijanta usmjerena na smanjenje nespecifične pozadine postupnim snižavanjem temperature žarenja kako PCR ciklusi napreduju. Temperatura žarenja u početnim ciklusima obično je nekoliko stupnjeva (3-5°C) iznad Tm korištenih primera, dok je u kasnijim ciklusima temperatura nekoliko stupnjeva (3-5°C) ispod Tm početnice. Više temperature daju veću specifičnost za vezanje početnica, a niže temperature omogućuju učinkovitije pojačanje specifičnih produkata nastalih tijekom početnih ciklusa.
• PAN-AC: Koristi izotermne uvjete za pojačavanje i može se primijeniti na žive stanice.
• Univerzalna brza šetnja kroz genom: za hodanje genomom i genetski otisak prsta korištenjem specifičnijeg "dvostranog" PCR-a od tradicionalnih "jednostranih" pristupa (upotrebom samo jednog genski specifičnog primera i jednog zajedničkog primera - što može dovesti do umjetnog "šuma") zbog mehanizma , uključujući formiranje laso strukture. Pojednostavljeni derivati ​​UFW su "Lane RAGE" (lasso ugniježđeni PCR za brzo umnožavanje krajeva genomske DNA), "5" RACE Lane" i "3" RACE Lane.
• UsilicoPCR(digitalni PCR, virtualni PCR, e-PCR, e-PCR) odnosi se na računalne alate koji se koriste za izračunavanje rezultata teorijske lančane reakcije polimeraze korištenjem danog skupa početnica (sondi) za umnožavanje sekvenci DNK iz sekvenciranog genoma ili transkriptoma.

Povijest PCR-a

U članku u Journal of Molecular Biology iz 1971., Kleppe i njegovi suautori prvi su opisali metodu koja koristi enzimatsku analizu za repliciranje kratke DNK šablone s početnicama pod uvjetima iz epruvete. Međutim, ova rana manifestacija osnovnog principa PCR-a nije dobila mnogo pozornosti, a izum lančane reakcije polimeraze 1983. općenito se pripisuje Karyju Mullisu.

Kada je Mullis 1983. godine razvio PCR, radio je u Emeryvilleu u Kaliforniji za Cetus Corporation, ranu biotehnološku tvrtku. Tamo je bio odgovoran za sintezu kratkih lanaca DNK. Mullis je napisao da je smislio PCR dok se jedne noći vozio autocestom duž pacifičke obale. Igrao je u mislima novi put analizu promjena (mutacija) u DNK kada je shvatio da je umjesto toga izumio metodu za povećanje broja kopija bilo kojeg dijela DNK kroz ponovljene cikluse duplikacije uzrokovane DNK polimerazom. U časopisu Scientific American, Mullis je sažeo proceduru: “Počevši od jedne molekule DNK genetskog materijala, PCR može generirati 100 milijardi takvih molekula u jednom danu. Ovu reakciju je lako izvesti. Ne zahtijeva više od epruvete, nekoliko jednostavnih reagensa i izvora topline.” Dobio je Nobelovu nagradu za kemiju 1993. za svoj izum, sedam godina kasnije kada su on i njegovi kolege iz Cetusa prvi put proveli svoj prijedlog u praksi. Međutim, ostaju neke kontroverze o intelektualnom i praktičnom doprinosu drugih znanstvenika Mullisovom radu, te o tome je li on bio jedini izumitelj PCR principa.

Metoda PCR temelji se na upotrebi odgovarajuće DNA polimeraze koja može izdržati visoke temperature >90°C (194°F) potrebne za cijepanje dvaju lanaca DNA u dvostrukoj spirali DNA nakon svakog ciklusa replikacije. DNA polimeraze, izvorno korištene za in vitro pokuse, predodređene PCR-om, nisu mogle izdržati tako visoke temperature. Stoga su rani postupci replikacije DNA bili vrlo neučinkoviti i dugotrajni, te su zahtijevali velike količine DNA polimeraze i kontinuiranu obradu tijekom cijelog procesa.

Otkriće 1976. Taq polimeraze, DNA polimeraze izolirane iz termofilne bakterije, Termusaquaticus, koji prirodno živi u vrućim (50 do 80°C (122 do 176°F)) okruženjima kao što su topli izvori, otvorio je put dramatičnom poboljšanju PCR metode. DNA polimeraza izolirana iz T.Aquaticus, stabilno na visoke temperature i ostaje aktivan čak i nakon denaturacije DNA, čime se eliminira potreba za dodavanjem novih DNA polimeraza nakon svakog ciklusa. To je omogućilo automatizaciju procesa umnožavanja DNK na temelju termalnog ciklera.

Patentni ratovi

Predloženu PCR metodu patentirao je Carey Mullis i zaslužna je za Cetus Corporation u kojoj je Mullis radio kada je izumio tehniku ​​1983. godine. Enzim Taq polimeraza također je zaštićen patentima. Bilo je nekoliko visokoprofilnih tužbi povezanih s metodologijom, uključujući neuspješnu tužbu koju je podnio DuPont. farmaceutska tvrtka Hoffmann-La Roche stekao je prava na patente 1992. godine i trenutno drži one koji su još uvijek zaštićeni.

Slična bitka za patent oko enzima Taq polimeraze još uvijek traje u nekim jurisdikcijama diljem svijeta između Rochea i Promege. Pravni argumenti nadilaze uvjete originalnih patenata za PCR i Taq polimerazu, koji su istekli 28. ožujka 2005.

Stranica pruža popratne informacije samo u informativne svrhe. Dijagnozu i liječenje bolesti treba provoditi pod nadzorom stručnjaka. Svi lijekovi imaju kontraindikacije. Potreban je savjet stručnjaka!

U kojim područjima medicine se koristi ova metoda?

• Izolirati i klonirati gene.
• Dijagnosticirati genetske i zarazne bolesti.
• Utvrditi očinstvo. Dijete nasljeđuje neke genetske karakteristike od svojih bioloških roditelja, ali ima svoj jedinstveni genetski identitet. Prisutnost u njemu nekih gena koji su identični roditeljskim genima - omogućuje nam da govorimo o uspostavljanju srodstva.

Na mjestu zločina forenzičari prikupljaju uzorke genetskog materijala. Tu spadaju: kosa, slina, krv. Naknadno, zahvaljujući tehnici reakcije polimerazom, moguće je umnožiti DNK i usporediti identitet uzetog uzorka s genetskim materijalom osumnjičene osobe.

U medicini se lančana reakcija polimeraze učinkovito koristi:

• U pulmološkoj praksi - za diferencijaciju bakterijskih i virusnih vrsta upale pluća, tuberkuloze.
• U ginekološkoj i urološkoj praksi - za određivanje ureaplazmoze, klamidije, infekcije mikoplazmom, gardnereloze, herpesa, gonoreje.
• u gastroenterološkoj praksi.
• U hematologiji - za određivanje onkovirusa i citomegalovirusne infekcije.
• U ekspresnoj dijagnostici takvih zaraznih bolesti kao što su virusni hepatitis, difterija, salmoneloza.

Trenutno se ova metoda najčešće koristi u dijagnostici zaraznih bolesti ( hepatitis virusne etiologije, HIV, spolno prenosive bolesti, tuberkuloza, krpeljni encefalitis).

Što se događa tijekom reakcije?

Reakcija polimeraze omogućuje otkrivanje infekcije, čak i ako je u uzorku s biološkim materijalom prisutna samo jedna ili nekoliko molekula DNA uzročnika.

Tijekom reakcije, zahvaljujući enzimu DNA polimeraze, dolazi do udvostručenja ( replikacija) dio DNK. Sama dezoksiribonukleinska kiselina DNK skraćeno) za nas je važan jer osigurava pohranu i prijenos genetskih informacija stanicama kćerima. DNK ima oblik spirale koja se sastoji od ponavljajućih blokova. Ovi blokovi čine nukleotide, koji su najmanja jedinica DNK. Nukleotidi nastaju iz aminokiselina.

Proces repliciranja dijelova DNK odvija se tijekom ponovljenih ciklusa. U svakom takvom ciklusu kopira se i udvostručuje ne samo izvorni fragment DNK, već i oni fragmenti koji su se već udvostručili u prethodnom ciklusu amplifikacije. Sve to podsjeća na proces geometrijske progresije.

Postoji:

• prirodno pojačanje ( odnosno proces kopiranja i umnažanja DNK), koji se događa u našem tijelu i deterministički je, unaprijed zadani proces.
• Umjetno pojačanje, koje nastaje zbog lančane reakcije polimeraze. U ovom slučaju, proces kopiranja je kontroliran i omogućuje dupliciranje čak i kratkih dijelova nukleinske kiseline.

Nakon trideset do četrdeset ciklusa, broj fragmenata doseže nekoliko milijardi.

Za pojačanje in vitro (in vitro) potrebno je da se u biomediju uzetom za dijagnostiku nalazi specifični strani fragment DNK ( to jest, ne DNK pacijenta, već patogena). Ako u stvorenoj otopini nema specifičnog fragmenta, lančana reakcija pod djelovanjem polimeraze neće započeti. To objašnjava činjenicu visoke specifičnosti PCR-a.

Faze PCR dijagnostike

6. Elektroforezom se rezultat zbraja, a rezultati udvostručenja izračunavaju.

Koje su prednosti ove dijagnostike?

• Svestranost: Svaki uzorak nukleinske kiseline prikladan je za ovu metodu.
• Visoka specifičnost: patogen ima jedinstvene sekvence DNK koje su specifične za njega. Stoga će rezultati provedene PCR biti pouzdani, nemoguće je zbuniti gen jednog patogena s genom drugog patogena.
• Osjetljivost na prisutnost čak i jedne molekule patogena.

• Mala količina materijala potrebna za istraživanje. Dovoljna je i kap krvi. Mogućnost dobivanja rezultata korištenjem minimalnog volumena uzorka vrlo je važna za pedijatrijska, neonatološka, ​​neurološka istraživanja, kao iu praksi sudske medicine.
• Sposobnost prepoznavanja trome, kronične infekcije, a ne samo akutne.
• Mnoge kulture koje uzrokuju bolesti vrlo je teško uzgojiti u epruveti drugim metodama, a reakcija polimeraze omogućuje razmnožavanje kulture u pravoj količini.

Koji su nedostaci ove dijagnostike?

• Ako materijal namijenjen za PCR sadrži DNK ne samo živog patogena, već i mrtvog, obje DNK će biti umnožene. Sukladno tome, liječenje nakon dijagnoze možda nije sasvim ispravno. Nakon nekog vremena, bolje je proći kontrolu učinkovitosti liječenja.
• Preosjetljivost na prisutnost mikroorganizama također se na neki način može smatrati nedostatkom. Dapače, u normi ljudsko tijelo prisutna je uvjetno patogena mikroflora, odnosno to su mikroorganizmi koji žive u crijevima, želucu i dr. unutarnji organi. Ovi mikroorganizmi mogu naštetiti osobi samo pod određenim nepovoljnim uvjetima - nepoštivanje higijenskih zahtjeva, kontaminirana voda za piće itd. PCR tehnika umnožava DNA čak i ovih mikroorganizama, iako oni ne dovode do patologije.
• PCR različitih testnih sustava može pokazati rezultate koji će se međusobno razlikovati. Postoje mnoge modifikacije ove tehnike: ugniježđeni», « asimetričan», « obrnuto», « kvantitativni» PCR i drugi.